酶联免疫吸附测定法（ELISA）是一种使用酶标仪进行测定的免疫测定法，用于检测和定量生物分子，例如抗体、蛋白质、激素或肽，以及表征蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸相互作用。在ELISA中，将用于实验的靶标（通常是抗原）固定在固体表面上，然后用辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）的酶缀合抗体进行检测。通过与被酶催化的底物孵育来实现定量，从而产生可测量的副产物。
ELISA测定法通常在96孔板中进行。这些板被设计成通常通过直接吸附到微量滴定板的表面上或间接地通过预先包被的抗体间接地结合和固定抗原。固定后，将一抗引入样品中，与抗原形成免疫复合物。一抗可以共价标记到酶（例如HRP）上，或者如果一抗被生物素标记，则一抗本身可以使用酶标记的二级抗体或链霉亲和素偶联物间接检测。通过与合适的底物孵育来评估共轭酶的活性，从而实现检测，该底物会产生可测量的副产物。试剂盒在灵敏度和成像设备的兼容性方面各不相同。 直接与间接检测 在ELISA中检测一级抗体-抗原复合物的方法可以是直接的或间接的（图1）。在直接检测方法中，与报告酶（例如HRP或AP）缀合的单一一抗可以直接检测靶抗原。通过间接检测，可以依次使用双抗体系统检测目标靶标。首先，将样品与针对目标抗原的未标记一抗孵育。然后，使用一抗特异的酶标二抗检测其存在，从而检测靶抗原。如果使用生物素化的一抗检测抗原，则使用酶标记的抗生蛋白链菌素偶联物作为您的第二检测试剂。 使用哪种检测方法取决于靶抗原的表达水平。为了检测高度表达的抗原，直接检测是合适的方法。当灵敏度至关重要时，例如检测低丰度靶标或表达不良的抗原，请使用间接检测方法来增强信号。 图1.使用靶标特异性抗体进行直接和间接抗原检测的图示。 1.直接法 在直接ELISA中，抗原通过被动吸附直接固定在板的表面，并使用HRP标记的一抗进行检测。将无色底物引入样品，该底物与酶结合物反应，并产生可测量的副产物。根据底物的选择，该副产物可以是比色的，化学发光的或荧光的。信号产生的大小与样品中抗原的数量成正比。在所有ELISA法中，直接ELISA分析最简单，执行最快，但灵敏度最低。 图2.直接法图解 直接法ELISA测定 优点 简单快捷，需要更少的试剂和更少的步骤 消除了二抗的交叉反应 缺点 抗原固定不明确会导致潜在的高背景干扰 一抗必须单独标记，这既费时又昂贵 酶对一抗偶联物的免疫反应性可能会产生不利影响 柔韧性低，因为必须偶联一抗 无信号放大 2.间接法 间接ELISA本质上是直接ELISA的修改版本。在间接ELISA中，用于检测抗原的一抗是未偶联的。取而代之的是，对一抗的宿主物种具有反应性的酶标二级抗体被用于检测一抗-抗原复合物（间接检测抗原）。将无色底物引入样品，该底物与酶结合物反应，并产生可测量的副产物。根据底物的选择，该副产物可以是比色的，化学发光的或荧光的。信号产生的大小与样品中抗原的数量成正比。与直接ELISA相比，使用辅助检测试剂具有明显的优势，即信号放大。 图3.间接法图解。 间接法ELISA测定 优点 方便-多种预标记的二抗可商购 经济–需要更少的标记抗体 高度敏感–一抗包含多种表位，可结合几种标记的二抗，导致信号放大 非常灵活–单个二抗可用于检测不同的一抗 保留一抗的最大免疫反应性 相同的一抗（例如生物素/链霉亲和素）可以使用不同的可视化标记 缺点 来自二抗的潜在交叉反应，导致非特异性染色 与直接ELISA相比更长的操作流程需要额外的孵育步骤 夹心ELISA分析是最常用的ELISA形式。它需要使用匹配的抗体对，从而每种抗体对抗原上不同的非重叠表位具有特异性。首先将一种抗体，称为捕获抗体，包被在多孔微量滴定板的表面上，以促进靶抗原的固定。然后，第二种抗体（称为检测抗体）与捕获抗体-抗原复合物结合。最后，添加对检测抗体（而非捕获抗体）具有特异性的酶标记的第二抗体偶联物。 图4.夹心法图解 夹心法ELISA测定 优点 高灵敏度–灵敏度比直接或间接ELISA形式高2至5倍 非常灵活–直接和间接检测均可使用 高特异性–由于使用了匹配的抗体对，因此可以特异性地捕获和检测抗原 适用于复杂，粗略或不纯的样品–抗原无需在测量前纯化 缺点 优化匹配抗体对可能很困难–捕获和检测抗体可能会发生交叉反应
ELISA的三种测定方法
3.夹心法
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