细胞自噬研究

2017-11-22 17:39:30 hlk 217

细胞自噬(autophagy)又称为Ⅱ型细胞死亡,是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。该过程中,细胞在自噬相关基因的调控下利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质,并被循环利用。

细胞自噬与细胞凋亡细胞衰老一样,是十分重要的生物学现象,参与生物的发育、生长等多种过程。细胞自噬的异常导致癌细胞的出现。

1. 细胞自噬分类

(1)巨自噬(macroautophagy)

    是指在其活动过程中,底物蛋白被一种双层膜的结构包裹后形成的自噬小泡(autophagosome),接着与溶酶体膜或者液泡膜融合,形成自噬小体。多在营养缺乏条件下培养的细胞、植物的免疫反应、叶片衰老及环境胁迫中产生应答。

(2)微自噬(microautophagy)

    是指溶酶体或者液泡内膜直接内陷底物包裹并降解的过程。多在种子成熟时储藏蛋白的沉积或萌发时储存蛋白的降解中起作用。

(3)分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediated autophagy,CMA)

在动物细胞衰老反应过程中,一些分子伴侣,如hsp70,能帮助未折叠蛋白转位入溶酶体,保存组成细胞结构的必要蛋白和其它材料。

2. 细胞自噬过程

(1)细胞接受自噬诱导信号后,在胞浆的某处形成一个小的类似脂质体样的膜结构,然后不断扩张,被称为Phagophore。
 (2)Phagophore不断延伸,将胞浆中的任何成分全部揽入,然后收口,成为密闭的球状的自噬体(autophagosome)。
 (3)自噬体形成后,可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合。
 (4)自噬体与溶酶体融合形成autolysosome,期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解,二者的内容物合为一体,自噬体中的物质被降解,产物(氨基酸、脂肪酸等)被输送到胞浆中,供细胞重新利用,而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。

3. 研究方法

    一般选用工具药物(诱导剂、抑制剂等)联合遗传学技术(Knockdown、突变株筛选、外源基因导入等)对自噬相关基因进行干预。 

4. 观察检测

    细胞经诱导或抑制后,需对自噬过程进行观察和检测,常用的策略和技术有:

(1)观察自噬体的形成

由于自噬体属于亚细胞结构,普通光镜下看不到,因此,直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为:新月状或杯状,双层或多层膜,有包绕胞浆成分的趋势。自噬体(AV1)的特征为:双层或多层膜的液泡状结构,内含胞浆成分,如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体(AV2)的特征为:单层膜,胞浆成分已降解。


(2)在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成

由于电镜耗时长,不利于监测自噬形成,人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时,GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中;自噬形成时,GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜,在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点,一个斑点相当于一个自噬体,可以通过计数来评价自噬活性的高低。

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(3)利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成

自噬形成时,胞浆型LC3(即LC3-I)会酶解掉一小段多肽,转变为(自噬体)膜型(即LC3-II)。这两种形式在正常细胞中都是存在的,而发生自噬的细胞中LC3-II会有明显的增加。

(4)MDC(Monodansylcadaverine,单丹磺酰尸胺)染色

    包括自噬体,所有酸性液泡都被染色,故属于非特异性的。

5. 自噬的调控

(1)依赖mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶点)途径的自噬
 1)PI3K-AKT-mTOR信号通路;
 2)AMPK-TSC 1/2-mTOR 信号通路。

(2) 其它的信号通路

1)3-甲基腺嘌呤(3-MA)通过抑制Class ⅢPI3K的活性抑制自噬;
 2)beclin1和UVRAG作为正调控子,抗凋亡因子bcl-2作为负调控子共同参与组成Class ⅢPI3 复合物调控自噬;
 3)GTP结合的G蛋白亚基Gαi3抑制自噬;GDP结合的Gαi3蛋白活化自噬;
 4)死亡相关蛋白激酶(death-associated proteinlinase,DAPK)和DAPK相关蛋白激酶(DAPK-related protein kinase-1,DRP-1)诱导自噬;
 5)PKA、casein激酶 Ⅱ、MAP激酶、calcium途径也在自噬错综复杂的调控网格中,但其机制还不甚清楚。

6. 自噬与疾病
 
(1) 自噬与代谢
     自噬能清除不正常构型的蛋白质,并消化受损和多余的细胞器,是真核细胞中广泛存在的降解/再循环系统;在细胞新陈代谢、结构重建、生长发育中起着重要作用;在饥饿和新生儿早期,自噬作用明显加强,自噬体显著增多。
(2)自噬与肿瘤
     细胞自噬与肿瘤的关系十分复杂,目前尚未完全阐明。一方面,正常细胞自噬增强,可表现出抑制肿瘤发生的功能;与此相反,抑制细胞自噬有潜在的致瘤可能。另一方面,肿瘤细胞也可通过增强细胞自噬来对抗由缺氧、代谢产物、治疗药物诱导的应激反应。