Western blot菜鸟问题集get

2017-12-07 16:53:55 hlk 148

华联科实验中心 

来来来,大家都看过来啦,先让侬们欣赏下实验室我龙哥的Western blot结果, 华联科实验中心我龙哥说了,你们随便看,有问题,随便问,来者不拒!

进入正题之前,给大家绕一绕western blot 这个名称的由来,着实是很有意思的。最开始做印迹工作的是一个叫做Southern的科学家,但印迹的对象是DNA链,他把这种技术称为Southern blot,后来类似的出现了两个过程相似,但是对象不同的印迹方法,一个针对RNA,一个针对蛋白质,人们分别把这两种技术称为Northern和Western,与这两个技术的发明人没有关系了。

哎呀呀,佩服不?这复杂的关系,几句话,明了!

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听我这废话连篇的,龙哥都听不下去了,入正题,入正题,入正题!---重要的事情写三遍!

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(1)  Western blot电泳中的问题

出现问题

原因

︶条带呈笑脸状

凝胶不均匀冷却,中间冷却不好; 电泳系统温度偏高

条带呈皱眉状

可能是由于装置不合适,特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡,或者两边聚合不完全

拖尾

样品溶解不好

纹理(纵向条纹)

样品中含有不溶性颗粒

条带偏斜

电极不平衡或者加样位置偏斜

条带两边扩散

加样量过多

 

2Western blot 结果中背景高且不均匀

 

可能的原因

建议

抗体浓度太高

1.一抗或二抗浓度太高会导致高背景,降低抗体浓度

使用的封闭液不兼容

1.对比不同的封闭缓冲液

非特异性位点封闭不足

1.优化封闭缓冲液,最好的封闭缓冲液具有系统依赖性

2.提高封闭液中蛋白的浓度

3.优化封闭时间和/或温度。室温封闭至少1 h或者4°C封闭过夜

4.在封闭液中加入Tween-20Tween-20的终浓度为0.05%

封闭液中与其它蛋白发生抗体的交叉反应

1.换一种不同的封闭液

2.不要用含抗生素蛋白的牛奶封闭,牛奶含生物素

3.交叉反应的检测。封闭一张干净的膜,与抗体一起孵育,然后用超感应化学发光底物检测

洗涤不充分,增加洗涤次数和使用缓冲液的体积

1.降低HRP结合物的浓度

2.如果洗涤液中无Tween-20,添加Tween-20使其终浓度为0.05%

膜的曝光时间过久

1.缩短印迹膜曝光到胶片的时间

2.按照说明书的指示,保证膜始终是湿润的

3.用一张新膜

4.保证膜完全被液体覆盖,避免其干燥

5.在孵育过程中始终进行震荡

6.小心夹膜——损坏膜可能导致非特异性结合

7.不能空手持膜,始终带干净手套或用镊子

缓冲液污染或结块沉淀

1.制备新的缓冲液

抗体浓度太高

1.若一抗和/或二抗浓度过高会产生高背景,降低抗体浓度

HRP处产生聚集体

1.0.2 μm过滤器过滤结合物

结合可产生斑点

1.用一种新的高质量的结合物

缓冲液中有污染

1.使用新的缓冲液

2.缓冲液使用前过滤

操作设备被污染

1.保证电泳仪器、印迹仪器和孵育用容器清洁,无外缘污染物

2.保证在转膜后没有凝胶留在膜上,蛋白可能黏在胶上导致背景

 

今天就说这些吧,我龙哥有些累了,想要继续了解关于Western blot的相关问题,记得持续关注我们呦~~

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