【收藏贴】如何规划我的CRISPR实验(一)

2017-12-08 11:39:57 hlk 148

摘要:

话说生物圈这几年最火热的技术,绝对非CRISPR莫属。这种新颖的基因组编辑技术凭借层出不穷的研究进展、热闹非凡的专利纷争,牢牢占据了各大杂志的头条。也许你也开始心动,希望尝一下“头啖汤”,但是纷涌而出的成果又让你不知从何下手。那么,现在就跟随我们,来规划一下你的CRISPR实验吧。

首先,你要考虑一下为什么使用CRISPR系统。永远破坏基因表达或功能(敲除)?表达突变型的基因(点突变)?还是增加或减少目标基因的表达?一旦你心中有数,那么后面就好办了。

一、CRISPR用于哪方面?

不同的遗传操作需要不同的CRISPR组件。确定了你的用途,相应地也就缩小了实验试剂的范围。需要注意的是,尽管这里介绍的内容主要针对哺乳动物细胞,但是许多原则也适用于其他物种。如果你挑选不到完美的质粒,可尝试一下独家定制。

华联科实验中心

 

二、表达系统如何选?

CRISPR听上去并不复杂,只是在你的目标细胞中表达gRNA和Cas9。这个表达系统的选择就要取决于你的具体应用了。假如你的细胞比较容易转染,像HEK293细胞,那么标准的转染试剂可能就足以表达gRNA和Cas9。对于一些较难转染的细胞,病毒导入不失为一个好选择。下表总结了一些主要的表达系统:

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当然,每种转导体系都有一定的优缺点,质粒和病毒的转导体系,需要针对每个目的基因进行构建,DNA 进入细胞后有潜在的整合基因组的风险,Cas9 的持续表达可能会增加脱靶效应。因此,对于转染效率高的细胞以及受精卵,首推Cas9 和gRNA 复合物。

三、重头戏来了!如何设计gRNA?

一旦你选好了CRISPR组件和导入方法,下一步就是选择目标序列,并设计gRNA了。

首先,你要了解你的细胞系和基因组序列,这关乎实验的多个因素。如果可能的话,你应当在设计gRNA之前,对计划修饰的区域进行测序,因为gRNA目标序列和真实序列之间的差异可能会影响切割效果。

之后,你就要确定对基因组中的哪个区域进行敲除或改造。这个具体位置将取决于你的特定应用。比如:在利用dCas9-激活子或dCas9-抑制子来激活或抑制目标基因时,gRNA应当针对目标基因的启动子区域;在敲除基因时,gRNA通常靶定5’端组成型表达的外显子,这样就降低了目标区域被剪接掉的可能性。同时,这个区域的移码突变也比较容易产生无功能的蛋白质。或者,可以让gRNA针对那些编码重要结构域的外显子。这样做的好处是,插入或缺失(通常由双链断裂产生)等非移码突变更可能改变蛋白质的功能;若使用同源指导修复(HDR),则目标序列必须靠近待编辑的位置。在这种情况下,你必须确定编辑发生的确切位置,并选择附近的目标序列。

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四、如何预测“on-target”和“off-target”活性?

大家都知道,在Cas9结合目标DNA时,PAM序列是必不可少的。因此,你必须确定待靶定的遗传区域内所有的PAM序列(SpCas9的PAM是5′ NGG 3′)。如果此区域内没有PAM序列,你可能要考虑另一物种的Cas9或SpCas9的的变体。一旦确定了所有PAM序列和假定的目标位点,下一步就是选择切割效率最高的位点了。

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显然,gRNA需要与目标序列匹配,但同时,又要确保它与基因组内的其他位点不匹配。如果这样的话,那就是完美!不过,现实情况是,基因组内总有几个部分同源的位点。这些位点就被称为“off-target(脱靶)”。当PAM序列的附近存在错配时,脱靶位点通常不会被有效切割。

除了“off-target”活性,我们还有必要考虑切割目标序列的活性,“on-target”活性。假设有两条gRNA,每条都与目标DNA 100%同源,但它们的切割效率却未必相同。举个例子,第20位(PAM上游1 bp)是G的gRNA可能比相同位置是C的gRNA更有效。因此,在设计gRNA时,有必要仔细确认每条gRNA的on-target和off-target活性。这时,你可以利用一些成熟的gRNA设计软件,或参考已发表的文献。

五、如何合成和克隆gRNA?

到了这一步,相信大多数人都会松一口气,毕竟最困难的部分已经过去了,下面都是大家熟悉的环节。市面上有很多成熟的sgRNA 体外转录试剂盒,操作十分简单,市面上也有很多公司有sgRNA 合成的业务,省时省力。