摘要

脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）作为革兰阴性菌细胞壁的核心致病成分，是激活机体先天性免疫反应的最强诱导剂之一。LPS炎症模型是目前研究感染性炎症、脓毒症、急性肺损伤及抗炎药物筛选最常用的实验工具之一。根据实验层次的不同，LPS炎症模型可分为体内动物模型和体外细胞模型两大类。本文系统阐述了LPS炎症模型的构建原理，详细介绍了小鼠、大鼠等常用动物的全身性炎症模型、急性肺损伤模型以及基于巨噬细胞、上皮细胞等的体外细胞炎症模型的建立方法与关键参数，总结了模型的鉴定指标体系（包括行为学、生化指标、细胞因子、组织病理学等），并分析了影响模型稳定性的主要因素。本文旨在为炎症相关研究领域提供一套系统、可操作的LPS炎症模型建立技术参考。

**关键词**：脂多糖；炎症模型；脓毒症；急性肺损伤；RAW264.7细胞；模型鉴定

一、引言

脂多糖是革兰阴性菌外膜的主要结构成分，在细菌裂解或增殖过程中释放，能够被宿主免疫系统高效识别。LPS通过与Toll样受体4（TLR4）结合，启动MyD88依赖性和非依赖性信号通路，激活NF-κB和MAPK等关键转录因子，诱导肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、IL-1β、一氧化氮（NO）等大量炎症介质的级联释放，最终引发局部或全身性炎症反应。

LPS炎症模型的建立始于20世纪80年代，经过数十年的发展，已形成从分子、细胞到整体动物水平的完整模型体系。该模型具有造模成本低、操作简便、可重复性高、病理特征明确等突出优点，被广泛应用于脓毒症、急性呼吸窘迫综合征（ARDS）、炎症性肠病、神经炎症以及药物抗炎活性评价等领域。然而，LPS模型的建立涉及菌株来源、剂量、给药途径、动物品系和检测时间点等多个可变参数，不当的选择可能导致实验结果偏差甚至模型失败。因此，系统掌握LPS炎症模型的标准化建立方法至关重要。

二、LPS诱导炎症的分子机制概述

LPS首先与血清中的LPS结合蛋白（LBP）结合，形成的复合物将LPS呈递给CD14分子，随后与TLR4/MD-2受体复合物相互作用。TLR4胞内的TIR结构域发生二聚化后，招募接头蛋白MyD88和Mal（TIRAP），启动MyD88依赖性通路。该通路通过IRAK家族激酶、TRAF6和TAK1，最终激活IκB激酶（IKK）复合物和MAPK级联反应。IKK使IκBα磷酸化并降解，释放NF-κB二聚体进入细胞核，启动TNF-α、IL-6等促炎基因的转录。同时，MAPK通路（p38、JNK、ERK）激活AP-1转录因子，协同增强炎症反应。

此外，TLR4还可通过TRIF和TRAM接头蛋白启动MyD88非依赖性通路，导致IRF3激活和I型干扰素（IFN-α/β）的产生，参与抗病毒免疫和晚期脓毒症的病理过程。理解这一信号网络是优化LPS炎症模型和筛选靶向药物的理论基础。

三、LPS体内炎症动物模型的建立

1. 实验动物的选择

**小鼠**是最常用的LPS炎症模型动物，以C57BL/6J和BALB/c品系为主。C57BL/6J小鼠对LPS诱导的内毒素休克敏感性较高，而BALB/c小鼠敏感性相对较低。**大鼠**（SD或Wistar）也常用于LPS模型，因其体型较大，便于多次采血和手术操作。**兔**和**豚鼠**在某些特定研究中仍有应用，但已非主流。一般而言，雄性动物因避免雌性激素周期对炎症反应的干扰而更常选用。动物周龄通常为6~8周（小鼠体重18~22 g，大鼠200~250 g）。

2. 全身性炎症（内毒素血症）模型

该模型模拟革兰阴性菌感染引起的脓

毒症/内毒素休克，是最经典的LPS体内模型。

**给药途径与剂量**：

- **腹腔注射（i.p.）**：最常用。低剂量（0.5~5 mg/kg）引起轻度炎症反应，适用于抗炎药效评价；高剂量（10~20 mg/kg）可诱导重度脓毒症，死亡率高（24 h内50%~80%）。

- **尾静脉注射（i.v.）**：起效最快，炎症反应强烈，但操作技术要求较高。小鼠常用剂量为5~15 mg/kg。

- **皮下或肌肉注射**：吸收较慢，炎症反应平缓，较少用于急性模型。

**典型病理过程**：LPS注射后1~2 h血清TNF-α达峰，随后IL-6、IL-1β先后升高；6~12 h出现体温变化（先降后升）、活动减少、竖毛、蜷缩等表现；12~24 h可出现多器官损伤（肝、肾、肺）和死亡率高峰。

**注意事项**：LPS来源和批次对模型影响显著。推荐使用大肠杆菌O111:B4或O55:B5来源的LPS，并预先进行预实验确定半数致死剂量（LD₅₀）。

3. 急性肺损伤（ALI）模型

LPS经气道给药可建立局限性肺部炎症模型，模拟急性呼吸窘迫综合征。

**建立方法**：

- **气管内滴注**：小鼠麻醉后仰卧固定，用微量注射器经口腔或气管切开插管，缓慢注入LPS溶液（20~100 μL），剂量为1~5 mg/kg（或每只小鼠10~100 μg）。滴注后将动物直立旋转，使LPS均匀分布于双肺。

- **鼻腔滴注**：无需手术，操作简便。小鼠轻度麻醉后，将LPS溶液（50~100 μg/40 μL）分次滴入双侧鼻孔，自然吸入。该方法形成的肺部炎症稍轻但更均匀。

**模型评估**：造模后6~24 h出现肺湿干重比升高、肺泡灌洗液（BALF）中总蛋白和中性粒细胞计数显著增加，炎症因子（TNF-α、IL-6、MIP-2）水平升高。肺组织HE染色表现为肺泡间隔增厚、炎性细胞浸润、透明膜形成及局灶性出血。

4. 其他LPS诱导的特定炎症模型

- **神经炎症模型**：通过脑室内注射（i.c.v.）或立体定位注射LPS（1~10 μg/只）至海马或黑质，可诱导中枢炎症反应，用于帕金森病、阿尔茨海默病研究。

- **关节炎模型**：关节腔内注射LPS（10~30 μg/关节）可诱导单关节炎模型，出现关节肿胀、滑膜增生和炎性细胞浸润。

- **肠炎模型**：LPS灌肠（1~5 mg/只）可建立急性肠道炎症模型，或与DSS联合使用增强肠炎表型。

四、LPS体外细胞炎症模型的建立

1. 常用细胞系

LPS可直接作用于多种免疫细胞和非免疫细胞，诱导炎症反应。最常用的细胞系包括：

- **RAW264.7**（小鼠巨噬细胞）：对LPS高度敏感，是抗炎药物筛选的首选细胞模型。

- **THP-1**（人单核细胞）：需经PMA诱导分化后使用，更接近人源反应。

- **BV-2**（小鼠小胶质细胞）：用于神经炎症研究。

- **A549**（人肺上皮细胞）：用于肺部炎症机制研究。

- **HUVEC**（人脐静脉内皮细胞）：用于血管炎症模型。

2. 模型建立的关键参数

**LPS浓度**：不同细胞类型对LPS的敏感性差异较大。一般建议范围：

- RAW264.7: 0.1~1 μg/mL（常用1 μg/mL）

- THP-1（分化后）: 0.1~1 μg/mL

- BV-2: 0.1~1 μg/mL

- A549: 1~10 μg/mL（敏感性较低）

**处理时间**：取决于检测指标。mRNA水平通常在刺激后2~6 h达峰，蛋白分泌（TNF-α、IL-6）在6~24 h内升高，NO在12~24 h后显著累积。建议预实验做时间梯度（2、4、6、12、24 h）。

**细胞状态**：使用对数生长期的细胞，铺板密度适中（如96孔板1~2×10⁴细胞/孔）。LPS处理前建议更换新鲜无血清或低血清培养基，以减少血清成分对LPS活性的影响。

3. 常见问题与优化

- **LPS活性下降**：LPS储备液应分装保存于-20℃，避免反复冻融。使用前超声处理或涡旋振荡可恢复其聚集状态，增强活性。

- **细胞毒性**：高浓度LPS（>10 μg/mL）对某些细胞具有直接毒性。建议同时设置CCK-8或MTT细胞活力检测，确保模型条件不引起过度死亡。

- **内毒素交叉污染**：培养器皿、试剂需确保无内毒素，否则会造成背景炎症反应升高。

五、模型的鉴定与评估指标

1. 体内模型鉴定指标

**行为学与一般状态**：观察动物活动度、竖毛、蜷缩、腹泻、眼鼻分泌物等。可设计临床评分系统（0-4分）量化病情严重程度。

**体温变化**：采用直肠测温法，LPS注射后早期（1-2 h）可能出现体温降低（内毒素休克特征），随后回升或持续低温（不良预后指标）。

**血清炎症因子**：ELISA法检测TNF-α、IL-6、IL-1β。典型峰值时间：TNF-α（1-2 h）、IL-6（2-6 h）。也可采用qRT-PCR检测肝、肺、脾等器官的炎症因子mRNA。

**器官损伤标志物**：ALT/AST（肝损伤）、BUN/CRE（肾损伤）、肺湿干重比、BALF总蛋白与细胞计数。

**组织病理学**：心、肝、肺、肾等重要脏器经固定、包埋、切片后行HE染色。采用半定量评分系统评价炎症细胞浸润、坏死、水肿等改变。

**生存曲线**：适用于高剂量LPS造模的死亡率观察，通常观察72 h或7 d。

2. 体外模型鉴定指标

**细胞活力**：CCK-8或MTT法，确保LPS处理后活力≥80%。

**炎症因子分泌**：ELISA检测上清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

**NO生成**：Griess法检测亚硝酸盐含量。

**信号通路蛋白**：Western blot检测IκBα降解、p65及p38/JNK/ERK磷酸化；免疫荧光观察p65核转位。

**炎症基因表达**：qRT-PCR检测Tnf、Il6、Il1b、Nos2、Cox2等基因。

六、影响模型稳定性的关键因素

1. LPS的来源与质量

不同血清型（O111:B4、O55:B5、O127:B8）及不同提取方法（酚提取、超滤）的LPS活性差异显著。同一实验应使用同一品牌同一批次的LPS，并记录批号。

2. 动物品系和性别

C57BL/6小鼠对LPS的敏感性高于BALB/c。雌性小鼠对LPS的炎症反应相对温和，可能与雌激素的免疫调节作用有关。建议选择单一性别（通常为雄性）以降低变异。

3. LPS的配制与储存

LPS粉末应避光、干燥、-20℃保存。配制时使用无菌无热原的PBS或生理盐水。分装小管（例如100 μL/管），避免反复冻融。临用前室温解冻并充分混匀。

4. 环境因素

动物饲养环境的温度、湿度、昼夜节律及饲料成分均可影响炎症反应的强度。建议造模前适应性饲养至少1周，实验在固定时间段（如上午9-11时）进行。

七、模型的应用与局限性

LPS炎症模型已广泛应用于：

- **抗炎药物筛选**：评价天然产物、合成化合物、生物制剂的体内外抗炎活性。

- **脓毒症机制研究**：探索免疫麻痹、代谢紊乱、多器官衰竭的分子机制。

- **急性肺损伤治疗策略**：评价干细胞、外泌体、气体分子（H₂S、CO）等的保护作用。

- **神经炎症与神经保护**：研究小胶质细胞激活在神经退行性疾病中的作用。

然而，LPS模型也存在局限性。LPS诱导的炎症以“内毒素休克”为核心，与活菌感染引起的复杂性脓毒症（涉及细菌播散、适应性免疫应答、菌群易位等）存在差异。因此，LPS模型更适合研究固有免疫驱动的炎症机制，对于需要适应性免疫参与的慢性炎症模型（如CIA、EAE），LPS模型并不适用。此外，不同物种对LPS的敏感性不同（人类对LPS的耐受性远高于小鼠），基于小鼠模型得出的结论需谨慎外推至临床。

八、结语

脂多糖炎症模型因其操作简便、成本可控、病理特征明确且具有良好的人体相关性，已成为炎症机制研究和抗炎药物发现中不可或缺的实验工具。无论是体内动物模型还是体外细胞模型，建立标准化、可重复的造模流程以及多维度、客观的鉴定指标体系，是获得可靠研究数据的关键。随着对LPS/TLR4信号通路认识的不断深入以及类器官、器官芯片等新技术的兴起，LPS炎症模型将进一步向仿生化、高通量和临床转化方向发展，为炎症性疾病的研究和治疗提供更强有力的支撑。

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