【科普】小鼠调节性T细胞鉴定方案

小鼠调节性t细胞(Treg)鉴定步骤

配色方案

小鼠Treg鉴定所需流式抗体

小鼠Treg鉴定所需辅助试剂

样本管设置

实验步骤

一、小鼠脾细胞分离步骤：

1.取小鼠脾脏，置于PBS中；

2.可用注射器柱塞研磨脾脏，并通过70μm细胞过滤器过滤，收集滤液到15mL离心管；

3.300g离心5min，弃上清，得到红色细胞沉淀；

4.加2mL 1x红细胞裂解液，重悬沉淀，室温下裂解2~3min，再加10mL PBS，终止裂解反应；

5.300g离心5min，弃上清，得到白色细胞沉淀，用细胞染色缓冲液重悬细胞，并做细胞计数，调整细胞浓度为1×107/mL。

二、细胞固定破膜实验步骤：

（下面是全染管的实验步骤，空白组不加抗体，单染管只在对应步骤加对应流式抗体，同型对照组将相应的流式抗体替换成同型对照，所有组都要固定破膜）

1.根据检测的量，稀释Foxp3检测专用的固定剂和破膜剂；

2.取100μL小鼠脾脏细胞（1×106个细胞），置于流式管内，加入1Test的FITC Anti-Mouse CD4（E-AB-F1097C）和1Test的APC Anti-Mouse CD25（E-AB-F1102E）混匀，4℃孵育30min；

3.孵育完毕后，加入1mL细胞染色缓冲液，300g离心5min，弃上清，再加入100μL细胞染色缓冲液，重悬细胞；

4.加入1mL固定剂，涡旋混匀，4℃反应30min；反应完成后，600g离心5min，弃上清；

5.加入2mL破膜剂，涡旋混匀，600g离心5min，弃上清；

6.重复步骤5；

7.加入100μL破膜剂，重悬细胞，再加入PE Anti-Mouse Foxp3（E-AB-F1238D），混匀后室温孵育30min；

8.加入2mL破膜剂，600g离心5min，弃上清；

9.加入200μL细胞染色缓冲液，重悬细胞，即可上机检测。

解析：

▶ 圈门路径：

首先，根据FSC-A和SSC-A圈中目的细胞；

其次，利用光散射特性，去黏连，得到单细胞；

再次，通过CD4，确定CD4+辅助T细胞；

最后，通过CD25+/Foxp3+，确定出Treg细胞亚群。

任何有关“流式实验”或“Treg研究”的疑问，可以给我们留言，我们将为大家详细解答哦~

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