原代细胞培养方法
原代细胞的培养方法
原代细胞的培养方法
原代细胞的培养也叫初代培养，是从供体取得组织细胞在体外进行的首次培养，是建立细胞系的第一步，是一项基本技术。原代细胞因刚从组织中分离开，生物学特性未发生很大变化，仍保留原来的遗传特性，也最接近和反映体内生长特性，适宜用于药物敏感性试验、细胞分化等实验研究。原代细胞往往有多种细胞组成，比较混杂，即使从形态上为同一类型(上皮样或成纤维样)，但细胞间仍有很大差异。如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差异也照样存在，原代细胞生物特性尚不稳定，如需做较为严格的对比性实验研究，还需进行短期传代培养。
1、组织块培养法
组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法，也是早期采用培养细胞的方法，故原先被称为组织培养。其方法:为将剪成的小组织团块接种于培养瓶(或皿)中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组织块粘着于瓶壁,使周边细胞能沿瓶壁向外生长，方法简便，利于培养，部分种类的组织细胞在小块贴壁24小时后细胞就从组织块四周游出，然后逐渐延伸，长成肉眼可以观察到的生长晕，5～7天后组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落和发生漂浮，此漂浮小块可随换液而弃去，由组织块周围延伸的贴壁细胞也逐渐形成层片，可在显微镜下观察形态和用于实验研究。其培养方法如下:
(1)按照前述方法取材,将组织剪成或切成1mm3大小的小块，并加入少许培养基使组织湿润。
(2)将小块均匀涂布于瓶壁，每小块间距0.2cm～0.5cm，一般在25mL培养瓶(底面积为17.5cm2)可接种20～30小块为宜，小块放置后，轻轻翻转培养瓶，使瓶底朝上，然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞，将瓶倾斜放置在37℃温箱内。
(3)培养24小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡,以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24小时后再补液，培养初期移动和观察时要轻拿轻放，开始几天尽量不去搬动，以利贴壁和生长，培养3～5天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。
2.消化培养法
该方法是采用前述的消化分散法，将妨碍细胞生长的细胞间质(包括基质、纤维等)去除，使细胞分散形成细胞悬液，然后分瓶培养。某些特殊类型细胞,如内皮细胞、骨细胞等的消化手段和步骤，将在有关章节中叙述。
3.悬浮细胞培养法
对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离,直接培养,或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。
4.器官培养
器官培养是指从供体取得器官或组织块后，不进行组织分离而直接在体外的特定环境条件下培养，其特性仍保持原有器官细胞的组织结构和联系、并能存活，器官培养的目的和技术均与单层细胞培养不同，但可利用器官培养对器官组织的生长变化进行体外观察。并观察不同培养条件研究对器官组织的影响。器官培养可保持器官组织的相对完整性，可用于重点观察细胞间的联系、排列情况和相互影响，以及局部环境的生物调节作用。体外器官培养为临床上的器官移植创造了便利的条件。器官培养的条件与细胞培养不同，要有特殊的要求。
1. 器官培养的特殊的要求
(1)需要特殊的培养条件因器官离体培养 ,其营养和氧气仅靠自然渗透来供给，因此，培养时为了确保中心不发生缺乏氧和营养而造成坏死，其厚度或直径不宜超过1mm。
(2)器官内部细胞需要有足够的氧气渗入常采用以下两种方法:
①将器官组织块置于培养基气液面以利于气体交换。提高培养基中的氧分压，一般需加注纯氧，提高氧分压时仍需保持5%C02，以维持pH。
2. 器官培养的方法
(1)将不锈钢网做成的支架，放置于培养皿中，高度为1/2 皿高，使其表面铺上0.5mm孔径的滤膜。
(2)将培养基加入平皿中,使培养液刚刚接触到滤膜,但不要使滤膜浮起。
(3)将要培养的器官组织平放在滤膜上，-般厚度不要超过200μm，水平面积不超过10mm2，如为肝、肾不能大于1mm2。
(4)将培养物置于CO2培养箱内，并加注氧气，调整氧分压达90%，培养时注意使液面与膜保持在一致的水平上。
(5)上述器官培养1～3周(每隔2～3天换液一次)后可用于实验和检测。
原代细胞的培养与维持
(一)原代细胞培养
1、静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞的培养)
凡经消化液处理实体组织来源的细胞要通过充分漂洗，以尽量除去消化液的毒性,细胞接种时浓度要稍大一些，至少为5×108细胞/L，培养基可用Eagle (MEM)或DMEM培养，小牛血清浓度为10%~80%，有条件的应在37℃ 5% CO2的培养箱中培养，在起始的2天中尽量减少振荡,以防止刚贴壁的细胞发生脱落，漂浮。若原代贴壁细胞不是用于长期培养，只是用于分离繁殖或测定病毒之用，其细胞浓度可以加大，尽量贴成厚层以利病毒的效价提高和测定结果(如空斑)更加明显、准确，待细胞基本贴壁伸展并逐渐形成网状,此时的pH若有明显变化,应将原代细胞换液，即倒去旧液,换入新鲜的培养基,以便除去衰老、死亡的细胞和陈旧的培养基，使贴壁细胞能获得充足的营养。若用骨髓或外周血中的悬浮细胞经静置培养1周时，可有少量的肌样纤维间质细胞或基质细胞开始贴壁生长,为了利于该贴壁细胞充分贴壁和生长，此时换液应将细胞悬液经低速离心后，按半量换液方式弃去旧液加入新液，然后再将细胞悬液放入原瓶中继续培养，经反复几次换液后,贴壁肌样细胞逐渐形成网状，此时换液可将原悬浮细胞和培养基移入另一新瓶，然后分别补加新鲜培养基(也按半量换液方式分别对半加入新液)继续培养，原瓶的贴壁细胞逐渐长成单层，而新瓶中又会出现二次贴壁细胞，经几次换液也会逐渐长成单层,在此类细胞培养时，培养基中往往需加入少量的维生素D3、 bFGF、地塞米松、小牛血清(浓度要在20%以上)，以利细胞贴壁生长。
2、悬浮细胞的培养
凡来自外周血、胸腹水、脾脏、淋巴结、骨髓的淋巴细胞、造血干细胞以及白血病细胞,在原代培养时要尽量去除红细胞。若作用于试验的短期培养，可在含10%小牛血清的RPMI1640培养基中进行培养,细胞浓度可在5～8×109/L范围内，然后进行分瓶试验。若要将淋巴细胞及白血病细胞进行长期培养，淋巴细胞中要加入生长因子,白血病细胞中要加入少量的原患者血清，以利细胞生长，待细胞开始增殖甚至结成小团块，培养基中pH变酸，说明细胞生长繁殖良好，-般每隔3天需半量换液一次(换液时尽量使细胞不丢失) ,待细胞增殖加快，浓度明显增加，pH发生明显变化时，此时可考虑传代。但千万不能急于传代，一定要待细胞密度较高时才能进行，以防传代失败。
(二)原代细胞的维持
1、贴壁细胞(包括半贴壁细胞的换液)
贴壁细胞长成网状或基本单层时，由于营养缺乏，代谢产物增多，pH 变酸，不适宜细胞生长，此时细胞还未长成单层，未达到饱和密度，仍需继续培养，因此，需采取换液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要。其换液方法比较简单，即弃去旧液，加入与原培养液相同的等量完全培养基。若希望细胞能在较长时间内能维持存活，但不需增殖，此时要换成含2%小牛血清的维持液。
2、悬浮细胞
凡经培养后只在细胞培养基中悬浮生长而不贴壁的细胞，需在倒置显微镜下方可观察到细胞的形态和生长现象，淋巴细胞的短期培养无需换液，但加入生长因子或有丝分裂源(PHA、PMA、COnA、PVM、LPS等)后，细胞不仅会发生转化而且会发生分裂繁殖，此时培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求，加之代谢产物增多，pH变酸，细胞不适宜生长，需进行换液。白血病细胞或淋巴瘤细胞体外长期培养时，都需换液培养，待达到饱和密度时才能传代。换液时，只能采用半量换液的方式，千万不能采取倒去旧液加入新液的方式进行换液。半量换液的方法如下:将原培养瓶竖起，在30分钟内,若细胞沉于瓶底，可用吸管轻轻吸去一半， 上清弃去，再加入等量的新鲜完全培养基。若细胞不能沉于瓶底，可吸出细胞悬液，采用低速离心( 1000r/min 10min)弃去一半上清加入等量的新鲜完全培养基，混匀后再转入原瓶继续培养。
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