小鼠骨髓间充质干细胞原代培养的流程

      现在国内已经有很多做原代培养技术成熟的公司和课题组，但由于自身平台有限很难联系到那些课题组，且对方可能也不愿分享，而商业公司多以技术壁垒、商业机密、专利等借口不愿意提供具体培养的细节，在网上也难以获取靠谱的实验流程，国内外的论文也是各执一词，没有形成统一、高效的培养体系；大多数科研者也没有时间和金钱去验证其真伪，有的文章培养出来的干细胞连三系分化验证图都没有，而流式细胞术的验证图想要造假并不难，故本人认为这些文章的真实性都存疑。

      本篇经验总结主要针对C57BL/6小鼠（简称B6）的骨髓间充质干细胞原代提取及培养，但从理论上讲也受用于其他种类小鼠。关于这个原代细胞，本人在ATCC上并未查见有细胞供应，加之间充质干细胞不具备长期多次传代并保持稳定的特性，故认为所有称其细胞来源于ATCC传代的细胞供应商均可认定为诈骗。之前看过一些论文称用间充质干细胞和另一个细胞融合或导入外源性端粒酶反转录酶基因获得了永生化的间充质干细胞细胞系，但这也只是一家之言，做科研最重要的品质就是对一切都抱有怀疑。若直接购买细胞无论是购买哪个公司的细胞均存在爆雷风险，所以还是想自己亲手做，毕竟实践才是检验真理的唯一标准。

      本经验的依据主要源自中国知网、pubmed小鼠骨髓间充质干细胞原代培养相关论文，国内做多物种原代细胞培养公司（SYSW和PNS）的一线技术人员和其他帖子，论文引用实在是太麻烦就不贴了。因本人目前尚未培养出小鼠骨髓间充质干细胞，故对下述很多知识都是自身臆测，均不作真实性保证，只为分享知识和观点。非常希望能受到有小鼠骨髓间充质干细胞培养经验的前辈指导。

一、关于动物、试剂选择的问题

1. 小鼠选材的问题。

      有人说小鼠周龄越小越好（这点符合生理学理论，小鼠越小骨髓内干细胞的比例越高），确实很有道理。据PNS技术相关人员称他们使用的小鼠为10~20天的C57BL/6或昆明鼠。但存在一个问题是越小的老鼠骨髓的总量也越少，举例说明（1只10天的小鼠一根骨头冲出的总细胞量假设为100000，其中间充质占了10%，也就是10000个；而30天的老鼠骨髓冲出的总细胞量为500000，其中间充质占2%，也是10000，当然上述数据只是为了方便大家理解，具体的东西我没去查询论文验证，但我觉得真要往深了做，这个里面有东西值得研究）。

      要我自己选择小鼠的周龄，我会先用周龄小的小鼠做，因为周龄小的小鼠干细胞的活性强、细胞干性高、细胞容易活，哪怕多用几只老鼠，只要能养出来就行（PNS的技术是用5只10天~20天老鼠的胫骨和股骨冲洗然后转移到1个25T的瓶里，多次换液长到80%后P1活细胞发货）。

2. 关于培养基选择的问题。

      在培养基选择方面绝大多数文章使用的基础培养基有3种，分别是DMEM、DMEM/F12、α-MEM（在这三种培养基中首先的一个问题的糖含量，DMEM低糖的葡萄糖含量是在1000mg/L，高糖的含量是4500mg/L，而DMEM/F12的糖含量是3000多一点点，具体数值记不清了，α-MEM的糖含量是1000。之前在一篇国外的论文中看到过关于高糖的DMEM会促进干细胞的分化和老化的描述，如果这个结论成立的话那理论上DMEM低糖和α-MEM应该是优于DMEM高糖和DMEM/F12的）。

      关于培养液中其他成分含量的问题主要集中在DMEM培养基中L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES的有无，α-MEM培养基中L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L谷氨酰胺、核苷有无。

对于L-谷氨酰胺的有无。

      这个问题我请教过我们基础学院一位专门研究人源性干细胞的老师，它的建议是基础培养基一定要有L-谷氨酰胺，其他的物质不是非必须的，L-丙氨酰-L谷氨酰胺是作为L-谷氨酰胺的替代物，我并没有找到文章论述他与L-谷氨酰胺在小鼠间充质干细胞培养的对比研究，但是根据其性质本人推测从理论上讲L-丙氨酰-L谷氨酰胺的效果可能优于普通的L-谷氨酰胺。培养细胞的人都知道L-谷氨酰胺在溶液中的不稳定性，在受热情况下会被降解为谷氨酸和氨，而氨对干细胞和原代细胞的影响是尤其大的，而L-丙氨酰-L谷氨酰胺性质更稳定，溶解度也大，在常温下也不容易降解，这对于干细胞的生长来说可能更有利。

关于丙酮酸钠。

      其作用是在葡糖糖含量较少或没有时作为细胞的碳源，即能量来源，由于DMEM和α-MEM内糖含量较低，我咨询了另一位研究小鼠卵母细胞的老师后，他给我的经验是以前养卵母细胞状态不好时通过加入丙酮酸钠可以有效的改善细胞的不良状态，故本人认为丙酮酸钠作为细胞的替代能量来源是有必要的。α-MEM培养基内丙酮酸钠是作为配方必需物存在的不需要作选择。

对于HEPE的有无问题。

      HEPES作为一种强效缓冲剂，在维持PH稳定方面优于普通的碳酸氢钠和磷酸二氢钠缓冲体系，个人觉得是一个锦上添花的东西，况且α-MEM中也无法选择HEPES的有无，故自己认为HEPES的有无对于细胞的生长无明显影响。

关于核苷的有无。

      核苷作为合成核酸的重要原粮，在胎牛血清中也含有一些核苷，细胞本身也可以合成核苷，但考虑到细胞快速增殖时细胞自身合成核苷的速度也许不够，故选择含核苷的培养基可能更好。

      综上所述，如果选择DMEM培养基可选择含L-丙氨酰-L谷氨酰胺和丙酮酸钠的，HEPES的有无看个人喜好；如果选择α-MEM可选择含L-丙氨酰-L谷氨酰胺和核苷的。

      有前辈的帖子提到α-MEM（L-谷氨酰胺）基础培养基，相比于DMEM（高糖、低糖）和DMEM/F-12效果更好，培养出的细胞增殖能力更强，细胞状态更好。另外PNS技术称他们自提小鼠原代骨髓间充质干细胞所使用的完全培养基是以α-MEM（含L-谷氨酰胺和核苷）为基础培养基加入10%的FBS配置的。结合这些经验，我自己会选择α-MEM（含L-丙氨酰-L谷氨酰胺和核苷）用于小鼠骨髓间充质干细胞的原代培养。

3. 关于血清选择的问题

      小鼠骨髓间充质干细胞对于血清等级的需求目前我不知道，但是我有养人脐带来源的间充质干细胞的经验，如果用有血清培养基培养，垃圾的血清肯定养不活，之前我用hyclone低糖的DMEM配biosharp的胎牛根本养不活，养一养就飘，然后就分化、老化，但是用来养癌细胞就嗷嗷长。根据专门研究人源性干细胞那位老师的经验如果用有血清培养基，血清的价格不要低于5000块/500ml，基础培养液不要低于500块/500ml。当然这些价格都是国外进口的官网价，实际在国内的一些代理商拿货可能也没这么贵。这是人的脐带间充质干细胞的要求，号称间充质干细胞里最难养的。小鼠骨髓间充质干细胞对于营养的要求可能会低点，但可以确信的是国产的那种新生牛或者很便宜的胎牛也够呛能养活，不知道国产替代的DMEM或是α-MEM能不能养出来。血清这个东西也有很多雷，指不定就买到假货啥的，所以尽量选择靠谱的购买。自己打算买gibco的澳洲优级胎牛10099141c先试试。

4. 关于添加辅助培养试剂的选择

      我自己对于商品化的成品细胞一直有个疑问，他们是如何在不同批次的血清和培养液的条件下均能培养出稳定的小鼠间充质干细胞。个人推测商品化的完全培养基内必定含有一些促进其增殖的生长因子以弥补血清中生长因子不足带来的影响，PNS的技术称其骨髓间充质干细胞完全培养基是专利产品，里面含有多种添加的生长因子，具体是什么含量是多少设计商业机密无法告知，但我在其官网上查到了它们运输骨髓间充质干细胞的培养基的成分，其中含有EGF和bFGF，所以我去查了文献发现这两个生长因子确有促进间充质干细胞增殖和生长的作用，但具体的浓度却不一。小剂量的EGF和bFGF肯定能促进间充质干细胞增殖，个人觉得可先尝试不加生长因子，如果细胞状态不好或是增殖缓慢可以尝试添加终浓度10ng/ml的EGF和bFGF，这个浓度不做保证，单纯臆测。除了生长因子，胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠等也对促进干细胞增殖有一定作用但没找到一篇成体系的文章描述具体的浓度和品牌。本人打算先不添加，视培养情况酌情而定。

5. 关于是否添加双抗的问题

      如果对自己操作自信可不添加双抗，另外细胞要是真的污染，加不加双抗可能都没啥用，个人不选择添加。

二、关于实验操作的问题

1. 关于提取方法的选择

      目前用于提取小鼠骨髓间充质干细胞的方法有很多，包括全骨髓贴壁、骨片消化、梯度离心、磁珠分选法，各种方法利弊我就不说了，这些都是比较容易获取的资料，但是我问了PNS和SYSW的技术都说使用全骨髓贴壁培养出来的，结合它们的成品细胞价格，我觉得用其他方法的可能性也不大。

      鉴于导师经费和操作难度，选择全骨髓贴壁法

2. 关于动物解剖的问题

      这一块涉及的雷很多，我看过一个视频直接将小鼠背部靠下皮肤剪开然后往下撕，把皮直接剥除后再操作，这种操作方式优点是视野清晰，毛发污染的可能性小，缺点是不是熟手可能直接在撕的时候把腹膜給撕破腹部内容物流出增加污染风险。第二种是在腹股沟皮肤处剪开然后撕下表皮，这种方法我觉得对于新手而言是比较理想的操作方式。

      我个人会选择第一种，因为曾经有一年多的动物实验中心工作经历，并且有一年多的外科临床实习经历，动手能力也较强，应该能hold住。

      暴露大腿之后涉及到取下股骨与胫骨的问题，视频看了几个，我觉得最好的方式是先剪断胫骨腓骨远端肌腱，然后剪断股骨上与髂骨连接的肌肉，拉扯整根大腿松动股骨大转子，最后将整根大腿取下，取下后减掉老鼠的脚，得到覆盖肌肉的股骨，髌骨与胫腓骨。用同样的方法将多只老鼠的覆盖肌肉的大腿全部取下，个人准备一次杀4只耗子取得8只大腿获取的细胞转入一个T25瓶里。

      下一步是将肌肉与骨分离然后取股骨和胫骨，个人觉得用镊子夹住股骨远端和胫腓骨近端反生理屈膝方向弯曲180度可以很有效的将股骨和胫腓骨分开，之后就将股骨上的肌肉和胫骨的肌肉剔除干净后放在含有PBS或完全培养液的培养皿中保持湿润。

3. 用注射器冲洗的问题。

      将所有胫骨和股骨取下后用眼科剪将干骺端减掉，暴露出骨髓腔，随后用1ml注射器进行冲洗，冲洗时应在冲刷干净和冲刷次数之间做好平衡，以此来减少细针头的剪切力对细胞的损伤；如果为了冲刷干净肯定冲洗次数就会增加这样就不可避免的累积剪切力对于细胞的损伤，另外将骨髓冲刷出来后不要进行红细胞裂解、离心等一系列操作，避免对细胞造成损伤，直接转入培养瓶或培养皿培养。

4. 冲洗后是否需要过筛的问题

      冲洗之后最好不要筛网过滤，因冲洗出的骨髓中存在少许团块组织，其中含有部分间充质干细胞，若筛网过滤会造成细胞损失，且筛网过滤会延长操作时间，增加污染风险和对细胞的损伤。冲洗及转移至瓶内的这个过程在保证不出错的情况下尽量缩短时间，以减少对细胞的损伤。

5. 对于培养容器种类、质地的选择问题

      对于无菌等级不高的实验室尽量选用细胞瓶代替培养皿培养可减少污染的概率，现在的培养瓶大多都是商品化的塑料培养瓶，因此在培养瓶质地选择这个问题上不用纠结，买一次性的塑料细胞培养瓶就行。

6. 关于换液时间的问题

      由于不同的protocol中培养容器各异，个人会选择25T培养瓶进行培养，换液时间选择24h，48h，72h换液1次，之后根据细胞生长状况调整换液时间，只要细胞正常增殖后就可以正常换液与传代。

7. 对于传代的倍数问题

      大部分的文章建议3代以前的细胞选择1：2传代，之后的细胞由于生长速度快，若传代密度大反而会导致细胞间相互接触而抑制生长并诱导其分化，所以3代以后尝试使用1:3传代。

8. 对于是否冻存的问题

     有文章建议干细胞最好不要冻存，以防影响其生长状态，且冻存和复苏次数最好不要超过1次，以防止冻存和复苏过程对细胞生长状态及分化的影响。