一篇骨髓间充质干细胞向神经细胞横向分化的综述
骨髓间充质干细胞转化为神经细胞及其在脊髓损伤治疗中的应用
每年全世界有数十万例的脊髓损伤发生，这给临床医生提出了很大的挑战，但直到目前为止，尚没有很好的治疗方法。自从发明应用类固醇激素抗炎治疗明显改善症状以后，没有新的疗效明显可靠的治疗方法诞生。但是随着近年来随着对脊髓损伤机理的认识的深化和相关技术的不断发明，对脊髓损伤的治疗手段有可能在不远的将来得到加强，这些给从事神经科学研究的学者带来了乐观的气氛 (1)。在这些方法中，细胞移植是一个主要的方向之一。
目前研究用于移植的细胞有胚胎干细胞分化的神经细胞、胎儿的神经干细胞、成体神经干细胞、嗅鞘细胞、雪旺细胞等。其中对胚胎和胎儿的神经干细胞研究比较多，但是胚胎和胎儿的神经干细胞的应用面临伦理学的问题，其来源有限难以满足临床需要，不能随时随地取材；供体细胞有传染疾病的可能，对供体要做严格的复杂的检测；细胞在体外的扩增较慢，而且需要用多种昂贵的生长因子调节其增殖和分化；有免疫排斥反应影响其功能的发挥。有鉴于此，近年来科学家对发现骨髓间充质干细胞向神经细胞分化表示了极大的兴趣。
骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells）的发现至今有135年的历史，在体外的分离培养有26年的历史。骨髓基质细胞是成分混杂的一组细胞，由细胞形态和生化特征都明显不同的细胞类型组成：骨髓成纤维细胞、脂肪细胞、成骨细胞、巨噬细胞和内皮细胞。骨髓基质细胞中非造血前体细胞也称为间充质干细胞（mesenchymal stem cell, MSC），BMSC和MSC的概念常被混用。近年来BMSCs日益成为研究的热门对象，原因是不断发现它有多种多样的分化能力，不仅能分化出中胚层的骨、软骨、肌肉、肌腱、脂肪、血管内皮等(2)，而且还令人惊奇地可以跨胚层横向分化（transdifferentiate）出内胚层的肝细胞(3)、肺泡上皮细胞(4)和外胚层的神经细胞。
骨髓基质细胞向神经细胞转化的发现
发现骨髓基质细胞能够向神经细胞转化是一个偶然的过程。为了研究成体动物的脑中的小胶质细胞来源是否可以来源于中枢神经系统外的造血系统，1997年Eglitis(5)将有逆转录病毒基因标记或者雄性小鼠的骨髓通过尾静脉注射移植到雌性小鼠的体内，用原位杂交的方法发现3天后移植的骨髓细胞通过了血脑屏障出现在受体的脑中，并且数量不断增加，广泛分布于脑皮质、海马、丘脑、脑干、小脑，表达小胶质细胞的标志F4/80，并令人惊奇地的发现表达星型胶质细胞的标志胶质纤维酸性蛋白GFAP(glial fibrillary acidic protein)。 移植4周后，GFAP阳性细胞占受体脑内存活的供体细胞的0.5% 到2%。
受此启发，在接下来的几年中，将骨髓基质细胞移植到脑组织中的研究成为一个热点。Azizi (6)等将人的骨髓基质细胞在体外培养，加入bis-benzamide中培养24小时标记，通过钻孔将10μl约100 000个细胞注射到大鼠脑中，分别在5、14、30、72天取材检测。实验发现72天后植入的细胞有约20 ％在大鼠脑中存活，并且沿着和植入的神经干细胞相同的路径迁移，广泛分布于脑中，移植的细胞不再表达Ⅰ型胶原，fibronectin（纤维结合素）的表达也明显降低。此项研究表明骨髓基质细胞在脑中有较强的存活或者增殖能力，表型也随移植的环境发生改变。
Brazelton等(7)实验在生理条件下诱导骨髓基质细胞向神经细胞转化。用表达GFP(green fluorescent protein，绿色荧光蛋白)的成年（8-10周）小鼠骨髓经过尾静脉注射到成年小鼠体内，每只小鼠注射6×106个有核细胞。2-12月后取材，发现GFP+细胞在脑中存活，20％以上不表达CD45和CD11b。GFP+细胞大部分（平均63.5％）表达F4/80（小胶质细胞/巨噬细胞的表型），无细胞表达GFAP，小部分（平均36.5％）细胞表达神经元特异性标志NeuN（neuron-specific nuclear protein，神经元特异性核蛋白）和NF-H（neurofilament- 200，神经微丝-200）。8-12周后移植小鼠的脑中约0.2-0.3 ％的神经元来源于移植的骨髓，并且骨髓来源的神经元和周围正常神经元一样对周围环境的变化产生反应，使CREB（cAMP反应元件结合蛋白）磷酸化。
Kopen等（8）将培养的骨髓基质细胞用CD11b抗体标记的磁珠分选出CD11b(－)细胞，把50 000个细胞/5μl注射到出生3天的新生小鼠的侧脑室中，12天后发现骨髓基质细胞遍布前脑和小脑，对脑部组织结构无破坏，在纹状体和小脑中发现来源于供体骨髓基质细胞的GFAP阳性细胞，在脑干的网状结构中发现来源于供体骨髓基质细胞的神经微丝阳性细胞。骨髓基质细胞在新生小鼠脑内的变化和发育中的脑组织一致。Kopen认为脑组织中分泌的FGF-2能促进骨髓基质细胞的增殖，分泌的神经营养因子能作用于骨髓基质细胞的神经生长因子的受体NGFR（9）促进其向神经细胞分化。
Mezey等（10）将50μl约1×107个雄性小鼠的骨髓细胞注射入出生24小时以内的雌性PU.1基因敲除的小鼠的腹腔中，其中含造血干细胞0.05到 0.5%，约0.125 %是基质细胞。1－4月后检测，脑内有2.3-4.6 ％的细胞Y染色体阳性，在脑中所有NeuN阳性的细胞中，有0.3-2.3 ％是Y染色体阳性，所有NeuN阳性的细胞NSE(neuron-specific enolase，神经元特异性烯醇化酶)染色也是阳性的。许多Y染色体阳性出现在侧脑室的脉络丛、室管膜和蛛网膜下腔中，表明脑脊液是这些细胞进入中枢神经系统的通道。
Priller等（11）用激光共聚焦显微镜观察活体脑组织在静脉注射移植了GFP标记的骨髓基质细胞后的变化，1-6月时脑内的GFP阳性细胞较少，但移植15月后发现小脑中有GFP阳性的成熟的浦肯野细胞（Purkinje cells ），表达γ氨基丁酸（GABA）合成酶，谷氨酸脱羧酶，表明细胞中有神经递质的合成。
骨髓细胞间充质干在体外诱导为神经细胞的研究
为验证骨髓基质细胞向神经细胞转化和进一步研究转化的条件，研究者又在体外进行了诱导骨髓基质细胞向神经细胞转化的实验。
Woodbury等（12）在2000年报道了在体外诱导骨髓基质细胞向神经细胞转化的实验，神经诱导液含抗氧化剂BME（β-mercaptoethanol，β-巯基乙醇）、DMSO（dimethylsulfoxide ，二甲亚砜）、BHA（butylated hydroxyanisole，丁羟茴醚）。在诱导液的作用下，部分骨髓基质细胞形态在60分钟后发生变化，3小时后反应细胞具有神经细胞的形态特征，扁平的胞体收缩，逐渐成球形，折光强，呈现 典型的核周体外形，同时细胞膜突起，形成初级和次级分支，以及生长锥样的末端膨大和可能的丝足突起。
和细胞外形的改变同步的是BMSCs的表型的变化。作者检测了多个指标，包括Nestin（巢素蛋白，一种中间丝蛋白，表达于神经上皮前体细胞，随神经细胞的成熟逐渐减少）、NSE、NF-M(一种神经元特异性中间丝，有助于轴突的延伸)、tau(分化过程中的神经元表达的神经元特异性的微管蛋白)、trkA（高亲和力的神经生长因子的受体）。实验结果表明，诱导后未反应细胞有轻微的NSE染色，而反应细胞的NSE表达不断增强，绝大多数胞体变为圆形有突起的细胞表达高水平的NF-M，部分反应细胞只在突起中表达NF-M，显示成熟神经元的表型，神经元样细胞的胞体和突起中均有tau表达。所有的神经元样细胞都表达NSE，但是只有一部分表达NeuN，暗示这部分细胞是有丝分裂期后的成熟的神经元。诱导5小时后，部分MSC来源的神经细胞高水平表达Nestin，随着诱导神经的延长，Nestin的表达逐渐减少，到第6天就检测不到了，但trkA从5小时到6天的时间段中持续表达，这些表明了神经细胞不断成熟的过程。反应细胞的GFAP染色为阴性，表明在体外诱导中，MSC不向星型胶质细胞分化。联合应用DMSO/BHA时诱导MSC成为神经元的比例最高，有约80％的细胞表达NSE和NF-M。
Mezey等（10）在体外检测BMSCs 的神经细胞表型，发现急性分离的细胞培养4小时后Nestin染色阴性，加入含PDGF（platelet-derived growth factor）10 ng/ml的DMEM-10% FCS中培养15天后，18-50％的细胞为Nestin阳性。
Sanchez-Ramos等（13）发现BMSCs用含EGF的培养液培养，表达Nestin的蛋白和mRNA，加入0.5mΜ RA(all-trans-retinoic acid,全反式视黄酸)、10ng/ml BDNF(brain-derived neurotrophic factor，脑源性神营养因子)和10％ FCS的诱导液后，BMSCs中fibronectin阳性细胞的数目明显减少，许多大而扁平的fibronectin阳性细胞变为有长突起的针样细胞或者小的卵圆形的细胞，其fibronectin阴性。NeuN阳性和GFAP阳性细胞分别占总细胞数的0.5 ％ 和1 ％。在BMSCs和神经细胞的共培养实验中，2.5×105个大鼠BMSCs种在2.5×105大鼠中脑细胞上，使用含RA和BDNF的N5培养基，2周后固定染色，约2-5％ BMSCs的NeuN阳性。人BMSCs和大鼠中脑细胞共培养1周后，2-4％ BMSCs的NeuN阳性，聚集在大鼠中脑细胞周围，呈椭圆形或者针形，但没有表达MAP-2（microtubule-associated protein-2），5-8％ BMSCs的GFAP阳性。共培养的实验表明，细胞之间的相互接触和营养因子、细胞因子对细胞的分化有重要作用。NeuN最开始出现在神经干细胞脱离细胞增殖周期开始向神经元分化的时候，而MAP2的表达在发育过程中晚于NeuN, 在新生大鼠一般多出现在出生后10-20天。BMSCs源的神经细胞表达NeuN而不表达MAP2说明细胞处于不成熟神经元的阶段，其向成熟神经元的分化需要进一步的长时间的实验观察。
Deng等（14）发现未分化的hMSCs表达某些神经细胞标志，如MAP1B，TuJ1 (neuron-specific tubulin)，NSE，Vimentin（波形蛋白）。用0.5mM IBMX (isobutylmethylxanthine)/ 1mM dbcAMP (dibutyryl cylic AMP)诱导hMSCs，2天后出现典型的神经元样外形，6天后占细胞总数的25 ％，而且有生长锥样末端结构和未分化细胞接触，细胞生长减慢，但未死亡。细胞表达NSE和Vimentin升高，但MAP1B和TuJ1没有变化，在未诱导和诱导细胞中均未发现NF-M、MAP2、tau、GFAP、S-100（成熟星型胶质细胞标志）、MBP(myelin basic protein，少突胶质细胞标志)的表达，说明hMSCs诱导成为早期的神经前体细胞。从诱导6天的hMSCs中撤去IBMX/dbcAMP后培养，所有神经元样细胞死亡，说明hMSCs向神经细胞分化是不可逆的。IBMX是磷酸二酯酶抑制剂，dbcAMP是cAMP的类似物，二者都可以提高细胞内的cAMP水平，诱导hMSCs成为神经前体细胞。
骨髓基质细胞修复脊髓损伤的研究
发现MSCs能诱导成为神经细胞后，研究者就开始尝试用MSCs移植治疗脊髓损伤。
Chopp等（15）将4μl 含2.5×105 MSCs 5分钟注射到脊髓损伤中心处，对照组用PBS注射。一、二、四周后脊髓内存活的MSCs分别是约为2.6×104、2.1×104和1.5×104个，在脊髓内迁移的范围分别距离注射中心2mm、＞2mm和5mm。用BBB (Basso-Beattie-Bresnehan)评分法分析脊髓功能恢复情况，术前为21分，脊髓挫伤后为0-6分，注射后为6.7-7.0分。对照组在注射4周后恢复到11.5分，到第3周后即为平台期，恢复缓慢，运动功能明显受限。注射MSCs组4周后恢复到15.3分，而且一直呈好转趋势，到4周时未出现平台期，大鼠四肢运动协调，可支撑身体重量。免疫组化发现脊髓室管膜细胞、胶质细胞和脉管系统表达Nestin增加，注射MSCs的脊髓内Rip(少突胶质细胞标志)变为阳性，植入的MSCs表达NeuN。作者认为，MSCs植入促进脊髓损伤恢复可能的作用机理为，受损的组织为移植的MSCs提供了微环境，产生信号诱导植入细胞表达细胞因子，促进室管膜细胞等的增殖，激活内源性的修复机制。
Hofstetter等（16）发现未经过诱导的MSCs有37.5% ± 1.2的Nestin阳性。将MSCs用 5 mM 2-mercaptoethanol（β-巯基乙醇）诱导48小时，进行膜片钳检测其电生理特性，发现没有表达钠、钾电压门控通道，不产生动作电位，说明诱导的神经元样细胞是不成熟的神经元。在T9脊髓挫伤处注射未经过诱导的MSCs，分为损伤后立即植入组和延迟一周植入组，植入的细胞数为30 000/10μl。5周后，立即植入组的功能恢复和阴性对照组无显著差异，但是延迟植入组明显促进功能恢复，BBB评分由7.9提高到9.2。对照组动物不能用后肢支撑体重，而延迟植入组的12只大鼠中有7只可以支撑体重，其中有2只恢复行走，前后肢协调，BBB评分为13分。5周后脊髓内的MSCs来源的细胞数延迟植入组有2,966个，而立即植入组只有518 ± 106个。移植前后MSCs的表型发生变化：Vimentin ++/－，Laminin +/－，Nestin ++/－， NeuN －/+。植入的MSCs形成束状纵向桥接病变区两端的组织，有较多的星型胶质细胞在其周围生长，排列规律。沿MSCs束发现5-羟色胺阳性的神经纤维，这些神经纤维的出现应该是改善损伤的脊髓功能的一个重要因素。
总之，虽然目前诱导MSCs向神经细胞转化的机理不清，不同研究者的诱导和观测方法不尽相同，结果不尽一致，但仍有充足的证据表明MSCs可以向神经细胞分化，这可以为用细胞移植治疗神经系统疾病提供方便的取之不尽的细胞来源，具有很大的临床应用前景。
参考文献
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15 Chopp M, Zhang XH, Li Y et al. Spinal cord injury in rat: treatment with bone marrow stromal cell transplantation. Neuroreport 2000 Sep 11;11(13):3001-5
16 Hofstetter CP, Schwarz EJ, Hess D et al. Marrow stromal cells form guiding strands in the injured spinal cord and promote recovery. Proc Natl Acad Sci U S A 2002 Feb 19;99(4):2199-204
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