细胞遗传学实验方法-淋巴细胞微核测定

一、淋巴细胞分离

分离使用Ficoll-Paque密度梯度分离淋巴细胞。将血液用磷酸盐缓冲盐水按 1:1 稀释，并在 Ficoll-Paque 上分层，血液 + PBS: Ficoll 的比例保持为 4:3。血液在室温下以 1800 rpm 离心 35 分钟。去除淋巴细胞层（血沉棕黄层）并在 PBS 中以 1200 rpm 洗涤两次，每次 10 分钟，然后用培养基 RPMI 1640 洗涤。用血细胞计数器计数细胞密度。

二、培养条件

淋巴细胞在 15 ml 锥形聚苯乙烯离心管中的 5% CO2 加湿培养箱中于 37o 培养。通常，每个培养物由 2 毫升培养基中的 1x10 6 个细胞的初始密度组成。培养基由补充有 10% 胎牛血清 2mM L-谷氨酰胺、100 单位/ml 青霉素、100 ug/ml 链霉素和 1.5% 植物血凝素的 RPMI 1640 组成。

在起始后 44 小时将微核测定细胞松弛素 B 加入到培养物中。细胞松弛素 B 阻止细胞完成胞质分裂，导致多核细胞的形成。细胞培养物中细胞松弛素 B 的最终浓度为 3 mg/ml。

在培养开始后 72 小时，使用细胞离心机 (Shandon, Sewickley, PA) 将淋巴细胞直接离心到载玻片上。然后将细胞以 600 rpm 的速度旋转到载玻片上 10 分钟。在室温下甲醇固定 15 分钟之前，让载玻片风干。载玻片在-20℃ 下储存在密封盒中，在 N2 下干燥。

三、细胞染色与微核测定

染色：将甲醇固定的载玻片在含有 0.1% Tween 20 的 PBS 中孵育 5 分钟。从载玻片中排出多余的液体，并用含有 0.2% Tween 20 的 PBS 1:1 稀释 40-50 ul 抗动粒抗体应用% Tween 20。然后将载玻片盖上盖玻片并置于 37oC 的加湿室中 1 小时。在含有 0.1% Tween 20 的 PBS 中洗涤两次，每次 5 分钟后，再次排出多余的液体，用 1:50 稀释的荧光山羊抗人 IgG覆盖载玻片并再次孵育 1 H。因为荧光标记的抗体暴露在光线下会褪色，此步骤和所有后续步骤应在黄灯下进行。将载玻片在加 0.1% Tween 20 的缓冲液中冲洗两次，并在抗褪色溶液中用 4'6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) (2 ug/ml) 复染。

细胞微核

对于淋巴细胞微核测试，对 1000 个双核淋巴细胞（那些经历了一次有丝分裂分裂的细胞）进行检测，每个重复培养物中的 500 个细胞，用于计算微核的数量。通过切换到荧光滤光片来确定动粒点的存在与否。

检测标准如下：

1) 细胞应具有完整的细胞质的圆形或椭圆形外观

2) 细胞核应同样为圆形或椭圆形，具有完整的核膜

3) 只有经历过一次核分裂的细胞才应检测微核的存在

4) 仅当微核大小为主核的三分之一或以下时才应计数

5) 微核的染色应与主核相似

6) 微核应与主核明显分开。

细胞染色

复制指数 (RI)，细胞分裂动力学的量度，通过计算每个样本 400 个总细胞中含有 1、2、3 或更多细胞核的细胞百分比，从对微核进行检测的相同载玻片上进行检测。复制指数RI 计算如下：

RI = (1x% 单核细胞) + (2x% 双核细胞) + (3x% tri) + (4x% 四核细胞）……

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