【主题学习】细胞实验总结

MTT原理：MTT是一种检测细胞功能的方法。细胞在活化增殖的过程中，线粒体的能量代谢能够把MTT代谢为蓝紫色的甲臜，甲臜沉积于细胞内或细胞周围，形成甲臜的量与细胞活化的程度成正比，通过盐酸异丙醇或其他溶剂溶解甲臜，用酶标仪测溶液的光密度就可以反映甲臜的量并从而判断细胞活化增殖的程度。

步骤：
1、培养好细胞种板。
      养细胞没啥好说的，如果不知道细胞如何养，那就看看相关的文献方法。如果知道了细胞的名字，就可以上www.atcc.org检索细胞的培养信息，这个网站上的培养方法是标准培养方法。当然可以根据自己实验要求进行修改。由于细胞计数很繁琐，种板时的细胞浓度是最难掌握的，这一点笔者的心得如下：
      自己先将细胞养一段时间，大概了解细胞的增殖情况，在MTT检测时实际上要求细胞大概能长满96-孔板的80-90%，如果打算养48小时就检测，根据细胞的生长情况反推种板时的细胞浓度状况。这时可以将细胞不进行计数，将消化好的细胞混匀后（可能是10ml）直接在一个废弃（最好进行过无菌处理）的96孔板中依次加入180、100、50微升细胞，将细胞放置几分钟就会沉到板底了，这时在显微镜下观察，推测哪个孔的细胞48 h能基本长满板底，假设50微升的孔比较合适，而种板时每孔需点200 微升，那么就将细胞浓度再稀释4倍就可以正式种了，这时顺便将细胞进行计数（因为实验记录要求写啊）。这样就OK了！如果细胞还太多，将细胞稀释4倍后再重复以上操作。注意：不要过分信赖细胞计数，因为细胞计数的取样量为20 微升左右，由于颗粒的分布不均匀，代表性是很差的。建议：细胞计数一定要会，但不要完全依赖它。
      种板时一定要将细胞消化成单个细胞，而且一定要混匀，最好用排枪，否则，MTT的SD会狂大！

2、种板布局。
      其实这一点很多人不懈一顾。如果你的细胞要养48 h或更长，建议不要吝啬96-孔板的四周边孔，这32个边孔不能使用，建议加入灭菌PBS以饱和中间64个孔的水分。因为细胞培养过程中，边孔的水分蒸发很快，培养液及里面的药物会出现浓缩现象，细胞的状况就复杂了，有些人称之为“边缘效应”这些孔的SD也会狂大，既然如此，不如不用。

3、将培养板取至无菌区域操作。

4、加入MTT溶液，使其占培养基体积的10%，MTT终浓度为5mg/ml。（培养基无酚红）
      注：加MTT的时候建议熄灭酒精灯，反正无菌无所谓了，还有我做MTT时，浓度1mg/ml都有结果，避光冷藏一周内用完
      如果确认你考察的药物没有氧化还原性，你可以直接加入MTT溶液（总体积的1/10），如果你没有把握，建议在加MTT前换一次液；如果你肯定考察的药物的氧化还原性很强，比如谷胱甘肽、Vit E、VitC，那建议你用PBS将细胞洗洗，否则这些药物会将MTT还原成棕褐色沉淀，这种效果可能是你不需要。

5、将培养板放回培养箱，孵育4h（有1-4h,3-4h等说法）。

6、孵育期结束后，将培养板从培养箱中取出，溶解蓝紫色产物甲臜（formazan)
A、如果是贴壁培养的细胞，去掉培养基，加入MTT溶解液，量等同于原来培养基的体积。1h内上机检测。
      注：MTT溶解液可以是酸化异丙醇（0.1N HCL+无水异丙醇）或是DMSO
      注：我觉得最好不要用PBS洗了，会损失紫色结晶的。我以前是一孔一孔的吸的，很麻烦而且会损失结晶，现在我去掉96孔板的盖子，铺几张滤纸在96孔板上，小心的翻过板来，孔中的液体会流出来，且不会损失肉眼可见的结晶。
B、如果不是贴壁培养的细胞，则直接加入MTT溶解液。

7、在摇床上轻摇有助于甲臜的溶解，上下吸取（碾碎）可能可以完全溶解甲臜，尤其是在高密度。

8、上机检测：
      双波长法：为了数据准确可以采用双波长法，双波长法是采用两束不同波长的光，一束测量样品称测定波长（λS）；另一束作为对照，称参比波长（λR）。两束光交替照射到斑点上，以吸收度之差ΔA定量。双波长可以消除酶标板不均匀的影响，使基线变得平稳。测定波长一般选测定组分的最大吸收波长，参比波长可选在组分无吸收的位置。这样可以增大ΔA。做MTT可以分选570 am实验波长和630 Bm参考波长在酶标仪上读出每孔光吸收值。个人认为，用酶标板检测时，干扰因素应该是不大的，可以用单波长检测。
      在理想的MTT实验中，如果是细胞抑制实验，不加药物处理组的吸收值应该在0.8-1.2左右，太小检测误差占的比例较多，太大吸收值可能已经超出线性范围。这个原理在朗伯-比尔定律中有解释。
      备注：做MTT时应该有调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜，用来调零。对照孔和加药孔基本是一样的，都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜只不过对照是加配药时的介质，而加药组加不同浓度的药。