如何做好细胞克隆形成

(一)实验目的

通过细胞在细胞培养板上的克隆形成能力来提示细胞的增殖能力。

(二)实验原理

克隆形成是测定细胞增殖能力的有效方法之一。单个细胞在体外持续6代以上，其后代所组成的细胞群称为克隆。这时每个克隆含有50个以上的细胞，大小在0.3-1.0 mm之间，通过计数克隆形成率，可对单个细胞的增殖潜力做定量分析，了解细胞的增殖能力和独立生存能力。

(三)实验流程

(四) 实验材料

生物安全柜、荧光显微镜、离心机、倒置显微镜、CO2培养箱；

完全培养基、胰酶、PBS、结晶紫、4%多聚甲醛。

(五)实验步骤

1.  准备感染后细胞[如果是克隆形成预实验，直接用空细胞进行实验] ：将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化，完全培养基重悬，制成细胞悬液，计数。

吸弃培养基

PBS清洗

加入胰酶

终止消化

收集细胞

离心获取沉淀

细胞计数

2.  细胞接种：于6孔板培养板中各实验组接种500-1000个细胞/孔[正常增殖速度为1:5-1:10传代，3天长满细胞，可以接种500个细胞，其余增殖缓慢细胞，可以接种800-1000；接种时注意梯度稀释细胞悬液，观察细胞密度，以免因计数不准确导致实验结果偏差] ，每个实验组设3个复孔，培养基为含30%FBS的完全培养基；

铺板

铺板后摇匀

3.  将接种好的细胞摇匀后轻放于培养箱中继续培养，每隔3 天进行换液并观察细胞状态，显微镜下观察克隆大小[3复孔之间克隆大小应相似] ，待单个克隆生长到大小不超过图片视野时可以进行拍照；

4.  拍完照之后的将6孔板放入培养箱中继续培养，待孔中大多数单个克隆中细胞数大于50为止，弃上清，PBS洗涤细胞1次。

5.  每孔加入1 mL 4%多聚甲醛[有毒，注意在安全柜中操作] ，4度冰箱固定细胞60 min，PBS洗涤细胞1次。

加入多聚甲醛

6.  每孔加入洁净、无杂质结晶紫染液1000 μL，染细胞2min。

7. ddH2O洗涤细胞数次，晾干，数码相机拍照整，克隆计数。

吸弃染液

加入超纯水清洗

晾干

拍摄

(六) 吉凯结果

1. 数码照相机拍摄结果

2. 荧光显微镜拍摄代表性克隆结果

(七) 实验操作参考文献

[1] Ruan J. et al. Increased expression of cathepsin L: a novel independent prognostic marker of worse outcome in hepatocellular carcinoma patients. PLoS One. 2014, 9(11):112-136.

[2] Sun R. et al. Down regulation of Thrombospondin2 predicts poor prognosis in patients with gastric cancer. Mol Cancer. 2014, 13:225.

[3] Ma Y. et al. Prostate cancer cell lines under hypoxia exhibit greater stem-like properties. PLoS One. 2011, 6(12):e29170.

[4] Suresh B. et al. Stability and function of mammalian lethal giant larvae-1 oncoprotein are regulated by the scaffolding protein RanBPM. J Biol Chem. 2010, 285(46):35340-9.

[5] Liu JW. et al. ssDNA-binding protein 2 is frequently hypermethylated and suppresses cell growth in human prostate cancer. Clin Cancer Res. 2008, 14(12):3754-60.